Nấm Mốc Và Vi Sinh Trên Nông Sản

Nấm Mốc Và Vi Sinh Trên Nông Sản

Lương thực, thực phẩm, đặc biệt là các nông sản chính như thóc, gạo, ngô, khoai, sắn, đậu, đỗ và lạc là nguồn năng lượng chính nuôi sống loài người, và các loài vật nuôi. Vì thế việc nghiên cứu để nâng cao chất lượng nông sản là một vấn đề quan trọng đang được các tổ chức quốc tế cũng như các nhà khoa học về lương thực thực phẩm của thế giới đặc biệt quan tâm. Việc nâng cao chất lượng nông sản bao gồm các kĩ thuật bảo quản gìn giữ các giá trị dinh dưỡng của chúng, ngăn chặn các chất độc hại nhiễm trên các nông sản đó đồng thời chế biến chúng thành những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao.

Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Do các hoạt động hết sức mạnh mẽ của các vi sinh vật có hại đã gây ra tổn thất lớn cho nông sản ở giai đoạn sau thu hoạch, trong đó tổn thất gây nên do nấm mốc chiếm một phần đáng kể. Ngoài việc gây tổn thất về lượng cho nông sản nấm mốc còn sinh ra các độc tố đặc biệt nguy hiểm với sức khoẻ con người và động vật kinh tế. Nấm mốc phát triển trên lương thực không những sử dụng các chất dinh dưỡng của hạt: Protein, glucid, lipit và các vitamin, chúng còn tiết ra các độc tố. Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus và Aspergillus moninus tạo ra là độc tố nguy hiểm nhất và thường nhiễm trên nông sản, gây độc cho người và gia súc, như gây tác dụng cấp tính, gây tổn thương gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến, …thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong.

Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố nấm trên lương thực, thực phẩm là vấn đề quan trọng nhằm bảo vệ sức khoẻ con người và các động vật kinh tế. Do vậy, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc, các độc tố mốc va vsv, các biện pháp phòng trừ độc tố mốc trên lương thực, thực phẩm. Giới hạn về mức nhiễm aflatoxin đã là một trong những tiêu chuẩn của an toàn vệ sinh thực phẩm. Chính vì vậy cần tìm hiểu thêm về các biện pháp phòng nấm mốc và vi sinh trên nông sản để nâng cao chất lượng nông sản.

1. Ảnh hưởng của nồng độ ion hydro (pH)

Phản ứng pH môi trường tác động trực tiếp lên vi sinh vật. Ion hydro nằm trong thành phần môi trường làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào. Tuỳ theo nồng  độ  của  chúng  mà  làm tăng  hoặc  giảm khả  năng  thẩm  thấu  của tế bào đối với những ion nhất định. Mặt khác chúng cũng làm ức chế phần nào các enzym có mặt trên thành tế bào.

Sự phát triển của vi sinh vật chỉ có thể rất nghiêm ngặt ở axit hay kiềm. Đối với vi khuẩn thuận lợi nhất là chúng phát triển trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Đối với nấm men và nấm mốc thì phát triển ở môi trường axit yếu.

Nếu nồng độ hydro trong dung dịch vượt quá mức độ bình thường đối với vi sinh vật nào đó thì sự sống bị ức chế. Thí dụ như trong quá trình làm dưa chua, độ axit dần dần tăng lên làm tiêu diệt những vi khuẩn gây thối, sau đó những vi khuẩn lactic.

Sự thay đổi pH môi trường có thể gây ra thay đổi kiểu lên men hay đặc tính lên men.

Trong điều kiện phòng thí nghiệm phần lớn chúng ta sử dụng những môi trường có pH đối với vi khuẩn 7 – 7,6; đối với nấm men và nấm mốc 3,0 – 6,0.

Ứng dụng ảnh hưởng của pH: Hiện nay người ta ứng dụng ảnh hưởng này trong sản xuất cũng như trong chọn giống vi sinh vật chủ yếu tạo điều kiện cho vi sinh vật có lợi phát triển và ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại. Thí dụ như trong đời sống người ta thường hay ngâm dấm, dầm dấm. Đó là một trong những cách bảo quản.

2. Ảnh hưởng của chất độc, các chất diệt khuẩn

Nhiều chất độc hoá học có khả năng tiêu diệt vi sinh vật. Khả năng tác dụng này có một ý nghĩa rất lớn trong kỹ thuật vi sinh vật học. Cơ chế tác dụng của chúng khác nhau, nói chung không đồng nhất, nó phụ thuộc vào bản chất hoá học của chất diệt vi sinh vật, phụ thuộc vào từng loài vi sinh vật.

Thí dụ: Este, alcol, dung dịch kiềm yếu tác dụng làm tan chất lipoit có trong thành phần tế bào. Muối kim loại nặng, kẽm, axit, phocmanlin làm đông tụ protein, làm thay đổi thành phần bào tương của vi sinh vật.

Axit nitric, clo, bột clo, permanganat kali, các chất hữu cơ oxy hoá mạnh có khả năng phá huỷ hẳn tế bào vi sinh vật, còn các chất khác như glyxerin, nồng độ đường và nồng độ muối cao gây áp suất thẩm thấu.

Các chất được ứng dụng trong kỹ thuật để tiêu diệt vi sinh vật còn gọi là chất diệt khuẩn. Hoạt tính diệt khuẩn của các chất hoá học phụ thuộc trước tiên vào cấu tạo, nồng độ chất, thời gian tác dụng của nó đối với vi sinh vật, loại vi sinh vật, thành phần hoá lý của môi trường và nhiệt độ của môi trường đó.

Ứng dụng: Các chất diệt khuẩn được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm phải đảm bảo những yêu cầu cơ bản sau:

1. Tác dụng diệt khuẩn mạnh ở nồng độ nhỏ.
2. Có khả năng tan trong nước
3. Chất diệt khuẩn không được có mùi, vị và không gây độc hại cho con người.
4. Bền vững trong bất kỳ điều kiện bảo quản nào.
5. Không gây tác dụng phá huỷ dụng cụ chứa cũng như thiết bị kỹ thuật.

Đối với vật dụng diệt khuẩn ẩm thì dùng chất hoá học ở dạng dung dịch, huyền phù hay bột còn chất khí thì dùng dạng khí hoặc dạng hơi. Các chất hóa học thường được ứng dụng để diệt khuẩn như sau:

Kiềm và muối

• NaOH 0,1% với pH = 10, trong nồng độ này vi sinh vật bị tiêu diệt trong 1 – 2phút ở nhiệt độ 40⁰C (không được dùng với thiết bị làm bằng nhôm).
• NaCO₃  1% hay 0,5% thường sử dụng ở nhiệt độ 55⁰C.

Halogen và những dẫn xuất

• Clor: Đây là chất diệt khuẩn rất mạnh. Nó có thể sử dụng ở dạng nước hay dạng  khí.  Tác  dụng  của  chúng  lên  tế  bào  dinh  dưỡng,  lên  bào  tử  không  đồng  đều. Nồng độ rất nhỏ cũng đủ tiêu diệt vi sinh vật.
• Phản ứng Clor với nước theo cơ chế sau: Cl₂  + H₂O → HOCl + HCl

Ngoài ClO₂  ra tác dụng diệt vi sinh vật còn có O và HCl

HOCl → HCl + O

• Bột Clo CaOCl₂  là dạng hypoclorit được ứng dụng nhiều trong công nghiệp. Thường thường sử dụng nồng độ 2%.
• Antifocmin thường được ứng dụng nhiều trong sản xuất bia. Antifocmin được điều chế từ ba thành phần bột Clor, hydroxit canxi, hydroxit natri.

Hợp chất kim loại nặng

Thường sử dụng nhiều là thuỷ ngân, đồng và bạc. Chúng ở dạng các hợp chất hữu cơ hay vô cơ. Các chất này chủ yếu là làm đông tụ protein của vi sinh vật.

• Clorua thuỷ ngân. Thường sử dụng ở trạng thái dung dịch ở nồng độ 1/10000. Nếu nồng độ 1/1000 sẽ tiêu diệt những tế bào dinh dưỡng trong vòng 1 – 30 phút. Và nồng độ 1/500 tiêu diệt bào tử vi sinh vật.
• Các hợp chất bạc. Thường sử dụng nhiều dạng khác nhau. Trong y học người ta sử dụng nitrat bạc. Trong công nghiệp thực phẩm người ta sử dụng một số hợp chất khác. Cơ chế tác dụng chủ yếu là do bạc tác dụng lên tế bào ở nồng độ 1:10.000.000.000.

Phenol và những dẫn xuất của chúng

Thường sử dụng rất nhiều những dẫn xuất khác nhau của phenol.

A. Cacbonlic (C₆H₅OH). Thường sử dụng với độ pha loãng 1:100. Ở nồng độ này phần lớn những tế bào dinh dưỡng bị tiêu diệt sau 5 – 10 phút. Trong nồng độ dung dịch 2 – 5% tiêu diệt nhiều tế bào gây bệnh.

Các chất khí

Thường sử dụng nhiều chất khí khác nhau. Rất nhiều chất khí có khả năng tiêu diệt vi sinh vật.

Foocmalin. Cơ chế tác dụng của chúng là lên nhóm amin của protit vi sinh vật dẫn tới làm biến tính chúng.

Nồng độ phocmalin 5% tiêu diệt bào tử sau 30 phút – 2% sau 60 phút, 1% sau 2 giờ. Để diệt khuẩn thường sử dụng dung dịch 2% được điều chế từ dung dịch 40% focmalin.

Ngoài ra người ta còn sử dụng SO₂  và một số chất khác trong công nghiệp nước uống.

4. Các sản phẩm trao đổi chất

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như nhiều sinh vật khác có hai quá trình đồng hoá và dị hoá. Hai quá trình này luôn luôn song song tồn tại. Do quá trình dị hoá mà nhiều sản phẩm trao đổi chất của chúng có tác dụng ngược lại quá trình đồng hoá.

Các sản phẩm trao đổi chất thường có tác dụng rất độc hại đối với vi sinh vật. Bình thường các vi sinh vật lấy các chất dinh dưỡng trong môi trường đồng thời thải các chất cặn bã ra xung quanh. Các chất thải này một mặt gây ức chế các quá trình hấp thụ thức ăn của vi sinh vật. Các sản phẩm trao đổi chất bao bọc xung quanh tế bào tạo thành một lớp làm cho các chất dinh dưỡng không chui vào trong tế bào được. Mặt khác chính các sản phẩm trao đổi chất này gây tác động ức chế sinh tổng hợp các hệ enzym và làm ức chế hoạt động của enzym.

Hiểu được tác dụng này người ta tiến hành nuôi vi sinh vật để thu sinh khối phải cải tiến nhiều cách để làm sản phẩm trao đổi chất ít gây độc hại đối với vi sinh vật. Các biện pháp đó như sau:

1. Khuấy trộn là một trong những phương pháp làm các thành phần trao đổi chất không bám xung quanh tế bào, không ức chế hoạt động của vi sinh vật.
2. Thổi khí cũng có tác dụng tương tự, đồng thời đẩy nhanh các chất khí độc hại ra khỏi môi trường.
3. Tiến hành nuôi cấy liên tục làm thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy, làm giảm nồng độ các chất thải của vi sinh vật trong môi trường.

15.4. Sử dụng phương pháp vật lý để khống chế vi sinh vật

Tăng nhiệt và việc dùng các phương pháp vật lý khác thường được dùng để diệt khuẩn. Các phòng thí nghiệm vi sinh vật đều dùng các nồi hấp áp suất cao (autoclave) để diệt khuẩn. Tăng nhiệt, qua lọc, chiếu tia tử ngoại, dùng bức xạ điện ly là 4 phương pháp vật lý thường được sử dụng.

15.4.1. Tăng nhiệt

Người Cổ Hy Lạp đã biết dùng lửa hay đun nước sôi để diệt khuẩn hay tiêu độc. Tăng nhiệt đến nay vẫn là phương pháp thường dùng nhất để diệt khuẩn. Chủ yếu có phương pháp dùng sức nóng ẩm và sức nóng khô.

Sức nóng ẩm dễ dàng gây chết virus, vi khuẩn và nấm (bảng 15.2). Trong nước sôi sau 10 phút có thể làm chết các tế bào dinh dưỡng và bào tử của các vi sinh vật có nhân thực. Nhưng nhiệt độ sôi (100°C) không đủ sức làm chết nội bào tử của vi khuẩn. Bào tử vi khuẩn có thể tồn tại vài giờ trong nước sôi. Do đó cách đun sôi chỉ dùng để đun nước uống hoặc để tiêu độc các vật phẩm không bị phá hủy trong nước sôi, không thể dùng để diệt khuẩn.

Vì tăng nhiệt là biện pháp rất quan trọng để khống chế vi sinh vật cho nên cần có một tiêu chuẩn chính xác đối với hiệu suất diệt khuẩn bằng sức nóng (heat-killing efficiency). Trước đây dùng điểm gây chết do nhiệt (thermal death point, TDP). Đó là nhiệt độ thấp nhất đủ để diệt hết vi sinh vật trong dịch huyền phù (suspention) sau 10 phút. Nhưng vì vi sinh vật chết theo phương thức logarit, cho nên trên lý thuyết không có thể tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật trong một mẫu vật, tức là phải kéo dài thời gian tăng nhiệt. Vì vậy có một phương thức biểu thị chính xác hơn và đã được tiếp nhận rộng rãi, đó là Thời gian giảm thiểu thập phân (decimal reduction time, D) hoặc gọi là Trị số D (D value). Trị số D là thời gian cần thiết để diệt hết 90% vi sinh vật hoặc bào tử trong một mẫu vật ở một nhiệt độ nhất định. Trên một đồ thị bán logarit (semilogarithmic plot) thấy rõ số lượng vi sinh vật biến đổi theo thời gian tăng nhiệt (hình 15.2). Trị số D là thời gian cần thiết để số lượng vi sinh vật giảm 10 lần. Trị số D liên quan đến tính đề kháng của vi sinh vật đối với các nhiệt độ khác nhau. Từ trị số D mà tính ra trị số Z (Z value). Trị số Z là nhiệt độ tăng lên đủ để làm giảm 1/10 trị số D. Một cách biểu thị khác là trị số F (F value) đó là thời gian cần thiết (tính bằng min.) đủ để diệt hết một quần thể tế bào hoặc bào tử ở một nhiệt độ nhất định (thường là 121°C).

Căn cứ vào trị số D ở các nhiệt độ khác nhau để tính ra trị số Z. Trị số Z có thể dùng để tính toán mối quan hệ giữa nhiệt độ và thời gian sống sót của vi sinh vật. Trị số Z là số nhiệt độ tăng đủ để làm giảm 10% trị số D. Trong đồ thị này trị số Z là 10,5⁰C. Trị số D biểu thị bằng thang logarit. (Theo sách của Prescott, Harley và Klein).

Trị số D và trị số Z được ứng dụng rộng rãi trông công nghiệp chế biến thực phẩm. Khi sản xuất đồ hộp cần xử lý nhiệt sau khi đưa thực phẩm vào hộp và hàn hộp lại. Cần xử lý nhiệt để đủ mức diệt được vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum. Vi khuẩn này gây ra độc tố botulism rất nguy hiểm. Xử lý nhiệt độ đủ dài để làm cho số lượng bào tử của vi khuẩn này nếu có từ 10¹² giảm xuống chỉ còn 1 bào tử (10°). Trị số D đối với bào tử vi khuẩn này ở 121°C là 0,204 min., vì vậy để tiêu diệt 10¹² bào tử xuống còn 1 bào tử cần 12D hay 2,5 phút. Trị số Z đối với Clostridium botulinum là 10°C – tức là tăng 10°C thì giảm được 10 lần trị số D. Nếu diệt khuẩn ở 111°C thì trị số D phải tăng 10 lần, tức là 2,04 phút và trị số 12D tăng lên đến 24,5 phút . Bảng 15.3 nêu lên trị số D và trị số Z của một số vi khuẩn thường gặp trong thực phẩm.

Có 3 số liệu đối với tụ cầu vàng (S.aureus), cho thấy tốc độ làm chết vi khuẩn này thay đổi phụ thuộc vào môi trường và hiệu quả bảo vệ của chất hữu cơ.

Với sức nóng ẩm phải cần nhiệt độ cao hơn 100°C thì mới có thể diệt được nội bào tử (endospores) của vi khuẩn, và cần có áp suất cao trong điều kiện bão hòa hới nước. Thiết bị diệt khuẩn thường dùng được gọi là autoclave (hình 15.3)

Về cơ bản autoclave cũng tương tự như nồi hầm chịu áp lực vẫn thường dùng trong gia đình. Tùy yêu cầu mà có cái dùng lửa, có cái dùng điện, có cái dùng hơi nước chuyển vào, có cái nhỏ, có cái vừa, có cái lớn hoặc rất lớn. Autoclave do nhà khoa học Chamberland phát minh ra vào năm 1884 và phát minh này đã thúc đẩy sự phát triển của Vi sinh vật học. Autoclave phải có van để đẩy hết không khí ra và trong nồi chỉ còn có hơi nước bão hòa. Có thể đóng van ngay từ đầu đợi áp lực nâng lên một ít rồi mới mở van để loại hết không khí ra. Cũng có thể mở van ngay từ đầu, khi thấy hới nước bay ra nhiều mới đóng van lại. Thường diệt khuẩn ở 121°C (áp suất 15 pounds) trong 15 phút. Có thể diệt hết mọi tế bào vi sinh vật và bào tử.

Diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm thông qua việc phá hủy acid nucleic, làm biến tính enzym và các protein khác, đồng thời còn có thể phá vỡ màng tế bào mà làm chết vi sinh vật.

Diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm phải tiến hành triệt để mới có hiệu quả. Khi chưa loại bỏ hết không khí thì ở áp suất 15 pounds nhiệt độ không thể đạt đến 121°C. Các vật cần xử lý không nên xếp chật quá cản trở việc tiếp xúc với hơi nước nóng. Lúc diệt khuẩn một bình có thể tích lớn thì phải giữ thời gian dài hơn, để làm cho toàn bộ dịch thể phải đạt tới 121°C. Chẳng hạn khi diệt khuẩn ở bình 5 lít thì phải xử lý trong 70 phút. Để khắc phục các nhân tố nói trên người ta thường xếp kèm với sinh vật chỉ thị khi diệt khuẩn các vật phẩm. Khi đó dùng ống (ampule) chứa môi trường dinh dưỡng vô khuẩn có thêm mảnh giấy có tẩm bào tử vi khuẩn Bacillus stearothermophilus hay Clostridium. sp PA3679. Diệt khuẩn xong phá vỡ ống trong điều kiện vô khuẩn và nuôi cấy vài ngày. Nếu sinh vật chỉ thi không sinh trưởng thì là việc diệt khuẩn đã thành công.

Người ta thường xử lý nhiệt ở độ sôi đối với sữa và nhiều chất khác. Phương pháp này gọi là phương pháp khử trùng Pasteur (Pasteurization) để kỷ niệm phát minh này của ông. Vào thập kỷ 60 của thế kỷ 19 do rượu vang bị nhiễm khuẩn, gây khó khăn cho việc bảo quản và vận chuyển, gây khó khăn cho việc sản xuất rượu vang ở Pháp. Pasteur đã dùng kính hiển vi quan sát thấy các trong rượu bị ô nhiễm có mặt các vi khuẩn lên men lactic và acetic. Ông thấy xử lý ở nhiệt độ 55-60°C có thể làm chết các vi sinh vật này và có thể bảo quản tương đối lâu dài rượu vang. Năm 1886 hai nhà hóa học Đức là V.H. Soxhlet và F.Soxhlet sử dụng kỹ thuật này để bảo quản sữa và làm giảm việc sữa lây truyền mầm bệnh. Năm 1889 phương pháp tiêu độc Pasteur với sữa được nhập vào Hoa Kỳ và người ta đã dùng phương pháp này để xử lý sữa, bia, và nhiều loại bđồ uống khác. Phương pháp tiêu độc Pasteur không đạt tới mục đích diệt khuẩn nhưng đủ làm chết các vi khuẩn gây bệnh, giảm mạnh các vi khuẩn không gây bệnh nhưng làm hư hỏng thực phẩm và làm chậm rõ rệt tốc độ biến chất của thực phẩm.

Có thể có hai phương pháp khử trùng sữa. Phương pháp tương đối cổ là xử lý ở 63 °C trong 30 phút. Còn phương pháp hiện thường được sử dụng là phương pháp khử trùng  ngắn (flash Pasteurization), còn gọi là phương pháp khử trùng ngắn ở nhiệt độ cao (high-temperature short-term, HTST), tức là xử lý ở 72°C chỉ trong 15 giây, sau đó nhanh chóng làm lạnh. Trong công nghiệp thực phẩm có lúc cũng còn dùng phương pháp khử trùng siêu nhiệt (ultrrahigh temperature, UHT), tức là xử lý sữa và các sản phẩm sữa ở nhiệt độ 140-150°C chỉ trong 1-3 giây. Sữa xử lý siêu nhiệt không cần bảo quản lạnh, có thể bảo quản hai tháng an toàn ở nhiệt độ phòng. Các gói cà phê kem (coffee creamer) cung cấp ở khách sạn thường được diệt khuẩn theo phương pháp này.

Nhiều vật phẩm có thể diệt khuẩn bằng sức nóng khô (dry heat sterilization). Đưa các vật phẩm này vào tủ sấy và giữ nhiệt độ 160-170°C trong 2-3 giờ. Vi sinh vật bị chết do bị oxy hóa các thành phần tế bào, và làm biến tính protein. Mặc dầu diệt khuẩn bằng sức nóng khô không có hiệu quả cao như bằng sức nóng ẩm. Bào tử của vi khuẩnClostridium botulinum bị chết ở 121°C sau 5 phút khi dùng sức nóng ẩm nhưng chỉ bị chết như vậy ở 160°C sau 2 giờ. Diệt khuẩn bằng sức nóng khô có những ưu thế riêng vì không làm ăn mòn các vật liệu thủy tinh và kim loại như sức nóng ẩm, có thể dùng để xử lý các dạng bột, dầu và các chất tương tự. Hầu hết các phòng thí nghiệm xửn lý hộp Petri và các pipét bằng sức nóng khô. Không thích hợp sử dụng phương pháp này để xử lý các vật phẩm bằng chất dẻo và cao su.

15.4.2. Nhiệt độ thấp

Nhiệt độ thấp được sử dụng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Đây là phương pháp quan trọng ngành vi sinh vật học thực phẩm. Ở nhiệt độ -20°C hay thấp hơn, vật phẩm bị đông lạnh, vi sinh vật bị đình chỉ sinh trưởng. Một số vi sinh vật bị chết vì các tinh thể băng là phá vỡ màng tế bào,.nhưng lạnh sâu không làm chết phần lớn các vi sinh vật nhiễm trên vật phẩm. Trên thực tế nhiều phòng thí nghiệm dùng các tủ lạnh sâu -30°C hay -70°C để bảo quản vi sinh vật. Vì thực phẩm đông lạnh có thể chứa nhiều vi sinh vật, cho nên khi làm tan băng phải xử lý ngay để tiêu thụ, tránh để tổn hại và để cho các vi sinh vật gây bện phát triển.

Bảo quản lạnh giúp làm chậm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, nhưng không đủ làm ngừng hẳn sự sinh trưởng. Đáng mừng là phần lớn các vi sinh vật gây bệnh là thuộc loại ưa ấm (mesophilic) và không sinh trưởng được ở nhiệt độ 4°C. Các vật giữ lạnh bị hư hỏng bởi các vi khuẩn ưa lạnh (psychrophilic) và chịu lạnh (psychrotrophic) nhất là khi có tồn tại nước, các tủ lạnh chỉ dùng để bảo quản ngắn hạn thực phẩm và các vật phẩm khác.

15.4.3. Qua lọc

Phương pháp qua lọc là phương pháp rất tốt để giảm thấp quần thể vi sinh vật đối với các vật liệu mẫn cảm với nhiệt độ và nhiều khi có thể dùng để diệt khuẩn các dung dịch. Qua lọc chỉ đơn giản là loại vi sinh vật khỏi dung dịch chứ không phải là diệt khuẩn. Có hai loại lọc vi sinh vật. Thiết bị qua lọc tầng sâu (depth filter): đó là loại thiết bị cấu tạo bởi sợi hay các vật chất dạng hạt, tạo thành một bản lọc khá dầy với những lỗ rất nhỏ. Dưới sức hút chân không dung dịch sẽ được lọc qua còn vi sinh vật bị giữ lại hay bị hấp phụ (adsorption) trên bề mặt bản lọc. Nguyên liệu để làm ra bản lọc này thường là đất Tảo silic (dimatomaceous earth) – đó là thiết bị lọc Berkefield. Còn có thể dùng một loại sứ (unglazed porcelain) – đó là thiết bị lọc Chamberlain. Hoặc còn có thể dùng thạch miên (asbestos) hay các nguyên liệu khác.

Gần đây người ta dùng thiết bị màng lọc (membrane filters) thay thế cho thiết bị qua lọc tầng sâu. Màng lọc hình tròn, dày khoảng 0,1mm và được chế tạo bởi acetate cellulose, nitrate cellulose, polycarbonate, fluoride polyvinylidene hay các chất tổng hợp khác. Các màng lọc có lỗ với đường kính khoảng 0,2μm là có thể dùng để lọc bỏ phần lớn các tế bào dinh dưỡng của vi sinh vật, trừ virus. Dịch lọc thường chỉ từ 1ml đến vài lít. Màng lọc được lắp cố định trên một giá đặc biệt

Dưới áp lực của máy hút chân không dịch lọc được chuyển sang một bình vô khuẩn. Loại thiết bị màng lọc này được dùng trong ngành dược, lọc thuốc đau mắt, chuẩn bị các môi trường nuôi cấy, các loại dầu, chất kháng sinh và nhiều vật chất kém chịu nhiệt khác.

1. Bình Erlenmeyer đựng dịch cần lọc
2. Dịch lọc được đẩy sang thiết bị màng lọc nhờ máy bơm
3. Thiết bị màng lọc (với các loại hình các kích cỡ khác nhau).

Phương pháp diệt khuẩn nhờ lọc còn dùng để lọc không khí. Hai ví dụ thường gặp là khẩu trang dùng trong ngoại khoa và nút bông dùng cho các ống nghiệm hay các bình nuôi cấy vi sinh vật. Không khí đi qua được nhưng vi sinh vật thì bị giữ lại bên ngoài. Phòng cấy Laminar thoáng khí nhưng an toàn sinh học (Laminar flow biological safety cabinet) đã sử dụng màng lọc không khí bằng các hạt hiệu lực cao HEPA (high-efficiency particulate filter). Nó có thể lọc được đến 99,97% các hạt có kích thước 0,3μm và được coi là một hệ thống lọc rất quan trọng. Người nuôi cấy vi sinh vật có thể thao tác thoải mái trong một phòng cấy mở một phần cửa nhưng rất an toàn nhờ luôn có một luồng không khí vô khuẩn được thổi từ phía trong và lại thoát ra qua màng lọc HEPA đặt ở phía trên. Khi thao tác với các vi sinh vật nguy hiểm như vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis, virus gây ung thư, các ADN tái tổ hợp… nhất thiết cần sử dụng phòng cấy này. Thiết bị này được dùng trong các phòng thí nghiệm, trong công nghiệp, như là công nghiệp dược phẩm, để chuẩn bị môi trường, thao tác thí nghiệm, nuôi cấy mô…

15.4.4. Bức xạ (radiation)

Bức xạ tử ngoại (Ultraviolet radiation-UV) với bước sóng 260nm có hiệu ứng diệt khuẩn rất mạnh, tuy nhiên không có khả năng xuyên qua thủy tinh, các màng bẩn, nước và một số cơ chất khác. Vì vậy UV chỉ dùng để diệt khuẩn trong một số trường hợp, ví dụ diệt khuẩn không khí trong tủ cấy, phòng nuôi cấy hoặc bền ngoài một số vật thể. UV có hại đối với da và mắt cho nên phải tắt đèn UV trước khi vào làm việc nơi có đèn này. UV cũng có thể dùng để diệt khuẩn nước, phải là một tầng nước mỏng đi qua đèn UV để đủ sức diệt mầm bệnh và các vi sinh vật khác..

Bức xạ ion hóa (ionizing radiation) hay bức xạ điện ly có sức xuyên rất mạnh và được dùng rất tốt để diệt khuẩn. Nó có thể diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử vi khuẩn, cả vi sinh vật nhân nguyên thủy (procaryotic) lẫn các vi sinh vật có nhân thật (eucaryotic). Tia gamma từ nguồn cobalt 60 được dùng để diệt khuẩn nguội đối với chất kháng sinh, kích tố (hormones), chỉ khâu vết thương, các vật liệu y học bằng chất dẻo (plastic) như ống tiêm… Tia gamma còn được diệt khuẩn và tiêu độc (pasteurize) đối với thịt và các thực phẩm khác. Bức xạ ion hóa có thể diệt các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm như Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni… Cả cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ (FDA) lẫn tổ chức Y tế thế giới (WHO) đều xác định tính an toàn của việc chiếu xạ này đối với thực phẩm. Đã có một nhà máy chiếu xạ thương phẩm ở gần Tampa (bang Florida). Tiếc rằng phương pháp này chưa được ứng dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ, nguyên nhân là do giá còn cao và nhiều người còn lo ngại các ảnh hưởng bất lợi của việc chiếu xạ lên thực phẩm. Gần đây, Chính phủ Mỹ đã phê chuẩn việc chiếu xạ lên thịt gia cầm, thịt bò, thịt lợn, thịt bê, thịt cừu non, hoa quả, rau củ và các chất điều vị. Việc chiếu xạ trong tương lai sẽ ngày càng được ứng dụng rộng rãi.

15.5. Sử dụng phương pháp hoá học để khống chế vi sinh vật

Mặc dầu người ta vẫn thường dùng các phương pháp vật lý để tiêu độc nhưng các tác nhân hóa học cũng thường được dùng để tiêu độc (disinfection) và phòng thối (antisepsis). Có nhiều nhân tố ảnh hưởng đếnhiệu quả tiêu độc và phòng thối bằng phương pháp hóa học. Chẳng hạn như loài vi snh vật, nồng độ và bản chất của các chất tiêu độc và phòng thối, thời gian xử lý,… Trước khi sử dụng các chất tiêu độc hay phòng thối thì bề mặt vật thể phải được làm sạch. Cần đảm bảo sự an toàn khi dùng hóa chất trong các phòng thí nghiệm hay trong bệnh viện. Hóa chất cũng được dùng để phòng chống sự sinh gtrưởng của vi sinh vật trong thực phẩm. Có nhiều loại hóa chất được dùng làm chất tiêu độc, mỗi loại đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Trước khi chọn sử dụng hóa chất nào phải hiểu rõ đặc tính của chất đó. Trong trường hợp pha rất loãng và có mặt chất hữu cơ thì chất đó vẫn có thể tác dụng có hiệu quả lên các nhân tố truyền nhiễm (vi khuẩn Gram dương, Gram âm, vi khuẩn kháng acid, nội bào tử của vi khuẩn, các loại nấm và virus…), mặt khác lại phải không có hại đối với cơ thể người, không làm ăn mòn các vật phẩm nói chung. Trong thực tiễn, rất khó đạt đến tiêu chuẩn vừa có hiệu lực vừa ít độc đối với cơ thể. Một số hóa chất tuy hiệu lực thấp nhưng vì khá vô hại nên vẫn được sử dụng. Chất tiêu độc phải ổn định khi bảo quản, không có mùi vị khó chịu, tan trong nước và trong dầu để dễ xâm nhập vào vi sinh vật và phải có sức căng bề mặt thấp để xâm nhập được vào các khe trên bề mặt. Nếu giá không cao càng tốt.

Một vấn đề nghiêm trọng là việc sử dụng quá mức Triclosan và các chất diệt khuẩn (germicides) khác. Chất kháng khuẩn (antibacterial) này hiện thấy có mặt trong các sản phẩm như chất khử mùi (deodorant), nước súc miệng, xà phòng, thớt cắt rau, đồ chơi trẻ em… Triclosan hầu như đang có mặt khắp nơi, hậu quả là đã xuất hiện các vi khuẩn kháng Triclosan. Ví dụ trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa đã có thể bài xuát chất này ra khỏi tế bào. Tương tự như trường hợp vi khuẩn phản ứng với việc dùng quá độ thuốc kháng sinh, vi khuẩn cũng sẽ có sự đáp ứng như vậy khi dùng quá mức các chất phòng thối. Hiện đã có bằng chứng cho thấy việc sử dụng rộng rãi Triclosan đã làm tăng tần số xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. Vì vậy việc dùng quá mức các chất phòng thối (antiseptic) có khả năng sinh ra những hậu quả khó lường.

Hoạt tính cao-có thể làm chết vi khuẩn kể cả vi khuẩn lao, bào tử, nấm, virus; Hoạt tính trung bình- làm chết mọi vi khuẩn, trừ bào tử; Hoạt tính thấp- làm chết tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn, trừ VK lao, làm chết nấm, virus có lượng lipid mức trung bình. Theo Symour S. Block, 1983.

Loại Phenol

Phenol là chất phòng thối và tiêu độc được sử dụng rộng rãi đầu tiên. Năm 1867 Joseph Lister đã dùng phenol để làm giảm nguy hiểm của việc nhiễm vi sinh vật trong quá trtình phẫu thuật. Hiện nay phenol và các dẫn xuất như các loại cresol, các loại xylenol và orthophenylphenol đã được dùng để làm chất tiêu độc trong các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Chất tiêu độc thương mại Lysol là một hợp chất loại phenol. Các chất loại phenol có tjhể làm biến tính protein và phá hủy màng tế bào. Chúng có ưu điểm là có thể diệt vi khuẩn lao khi có mặt các chất hữu cơ. Sau khi sử dụng có thể duy trì tác dụng khá lâu trên bề mặt vật thể. Nhưng chúng có mùi khó chịu và có thể làm kích thích da.

Hexachlorophene là một chất phòng thối thường dùng vì có thể làm giảm số lượng vi khuẩn trên da và duy trì được khá lâu, nhưng nó lại có thể làm tổn thương não cho nên hiện chỉ dùng trong bệnh viện khi có sự bộc phát của Tụ cầu khuẩn Staphylococcus.

Cồn

Cồn là một trong những loại thuốc tiêu độc và thuốc phòng thối thường dùng. Cồn có thể làm chết cả vi khuẩn và nấm nhưng không làm chết được bào tử. Một số virút chứa lipid cũng bị cồn làm chết. Ethanol và Isopopanol là hai loại cồn thường dùng để diệt khuẩn, nồng độ thường dùng là 70-80%, nồng độ này làm biến tính protein, còn có thể làm hòa tan màng lipid. Để diệt khuẩn nhiệt kế và các dụng cụ nhỏ cần xử lý bằng cồn trong 10-15 phút.

Các Halogens

Halogen là một trong 5 nguyên tố thuôc nhóm VIIA của bảng tuần hoàn (Fluorin-F, Chlorine-Cl, Bromine-Br, Iodine-I và Astatine-). Ở trạng thái tự do các phân tử tồn tại dưới dạng 2 nguyên tử liên kết với nhau. Cúng có thể tạo thành muối với sodium (Na) hay các kim loại khác. I và Cl là hai loại kháng vi sinh vật quan trọng. I thường được dùng làm thuốc phòng thối (antiseptic) ngoài da. Nó làm chết vi sinh vật do oxy hóa các thành phần tế bào, iod hóa (iodinating) các protein. Với nồng độ cao có thể làm chết bào tử, nói chung là sử dụng tinture d’iode (tinture of iodine) – tức là IK với nồng độ 2 % hay cao hơn iodine trong dung dịch nước-ethanol. Mặc dầu I là chất phòng thối có hiệu quả nhưng cũng có thể làm tổn thương da, có thể làm biến màu da, còn có thể gây dị ứng (allergie). Gần đây người ta sử dụng iodophore – hợp chất của I với một chất hữu cơ. Iodophore tan trong nước, không làm bẩn màu da, có thể giải phóng dần Iodine nên giảm tổn hại và giảm kích thích da. Loại tiêu độc da và dùng trong phòng thí nghiệm phổ biến là loại có nhãn hiệu là Wescodyne, còn loại tiêu độc vết thương thường dùng loại có nhẫn hiệu là Betadine.

Iodine thường được dùng để tiêu độc nước tiêu dùng tại thành thị và các bể bơi. Cũng được dùng trông công nghiệp sữa, công nghiệp thực phẩm. Có thể dùng khí chlorine, sodium hypochlorite hoặc calcium hypochlorite. Khi sử dụng chúng biến thành HClO rồi giải phóng nguyên tử oxy: Sẽ xảy ra sự oxy hóa các tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn, nâm nhưng không có tác dụng với bào tử:

Cl₂ + H₂O→ HCl + HClO

Ca(OCl)₂ + 2H₂O → Ca (OH)₂ + 2 HClO

HClO → HCl + O

Dưới tác dụng của chúng hầu như tất cả vi sinh vật sẽ bị giết chết trong vòng 30 phút. Vì phản ứng của chất hữu cơ với tác động của Cl và các dẫn xuất của Cl nên đã can thiệp vào tác dụng diệt khuẩn của Cl cho nên người ta thường sử dụng quá lượng Cl để bảo đảm hiệu quả diệt khuẩn. Có một khả năng là Cl phản ứng với chất hữu cơ hình thành nên những hợp chất gây ung thư trihalomethanes, cho nên trong nước uống cần phải kiểm tra sự tồn tại của chất này. Tại Châu Âu và Canada đôi khi người ta sử dụng thành công ozone để thay thế cho việc chlorine hóa (chlorination).

Cl là một chất tiêu độc tốt, khống đắt, lại dễ dàng sử dụng nên rất hay được sử dụng. Với một lượng nước uống nhỏ có thể tiêu độc bằng những viên halozone. Halozone (acid parasulfone dichloramidobenzoic) sau khi đưa vào nước sẽ từ từ giải phóng ra chloride, sau khoảng nửa giờ có thể đạt tới mục đích tiêu độc. Chất này thường được sử dụng trong trường hợp thiếu nước sạch để uống.

Dung dịch Cl là chất tiêu độc có hiệu quả trong gia đình và trong các phòng thí nghiệm. Có thể dùng nồng độ pha loãng 100 lần dịch tẩy trắng gia dụng (household bleach) phối hợp với chất tẩy không ion hóa (non ionic detergent) sao cho nồng độ chất tẩy vào khoảng 0,8%. Hỗn hợp này vừa làm sạch vừa loại bỏ vi khuẩn

Các Kim loại nặng

Trong nhiều năm các ion kim loại nặng như Hg, Ag, As, Zn và Cu thường được dùng để làm chất diệt khuẩn (germicides). Nhiềug kim loại nặng có tác dụng ức chế vi sinh vật (bacteriostatic) hơn là diệt khuẩn. Hiện các chất này đã được thay thế bằng các chất khác có độc tính thấp hơn và có hiệu quả hơn. Nhưng cũng có thường hợp ngoại lệ, ví dụ dung dịch 1% AgNO₃ thường được dùng làm thuốc nhỏ mắt để phòng bệnh lậu ở mắt (trong nhiều bệnh viện người ta dùng Erythromycin để thay thế nitrat bạc vì chất kháng sinh này có hiệu quả chống

cả Chlamydia lẫn Neisseria. Bạc sulfadiazine thường được dùng trong điều trị bỏng. CuSO₄ thường được dùng để diệt tảo có hiệu quả trong ao hồ và các bể bơi.

Kim loại nặng kết hợp với protein , làm bất hoạt protein và cũng có thể làm kết tủa protein của tế bào.

Các muối ammon bậc bốn (Quaternary Ammonium Compounds)

Các chất tẩy (Detergents – từ gốc La Tinh detergere có nghĩa là loại trừ) là những phân tử hữu cơ được dùng làm các chất giữ âm (wetting agents) và nhũ hóa (emulsifiers) vì chúng vừa có cực thân nước (polar hydrophilic) vừa có những gốc phi cực kỵ nước (nonpolar hydrophobic ends). Chúng có thể làm tan các chất khó hòa tan bởi các phương pháp khác, vì vậy dùng làm chất tẩy rửa, giặt giũ rất có hiệu quả, nhưng cơ chế khác với các chất béo có trong xà phòng.

Mặc dầu các chất tẩy dạng ion có chức năng kháng vi sinh vật nhất định nhưng chỉ có các chất tẩy rửa cationic (ion dương) mới có tác dụng tiêu độc. Thường dùng nhất là các muối ammon bậc bốn, chúng làm phá vỡ màng tế bào, cũng có thể làm biến tính protein.

Các chất tẩy cationic như Benzalkonium chloride và Cetylpyridinium chloride có thể giết chết phần lớn vi khuẩn nhưng không giết được vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis và các nội bào tử. Chúng có ưu điểm là ổn định, không độc và không gây kích thích… nhưng lại bị mất tác dụng trong nước cứng (hard water) và nước xà phòng. Các chất tẩy cationic thường được dùng để làm chất tiêu độc đối với bát đĩa, các thiết bị nhỏ và để xử lý ngoài da. Zephiran có chứa benzalkonium chloride và Ceepryn có chứa cetylpyridinium, chloride là các mặt hàng thường gặp trên thị trường.

Các Aldehyde

Hai loại aldehyde thường được sử dụng là Formaldehyde và Glutaraldehyde. Chúng có phản ứng rất mạnh, có thể kết hợp với acid nucleic và protein và làm bất hoạt chúng, còn có thể làm bất hoạt thông qua việc liên kết chéo (crosslinking) và alkyl hóa (alkylating). Chúng có thể làm chết bào tử, có thể dùng làm chất diệt khuẩn hóa học. Formaldehyde thường được dùng dưới dạng hòa tan trong nước hay trong cồn. Dung dịch đệm 2% glutaraldehyde là một loại chất tiêu độc có hiệu quả và thường được dùng để tiêu độc các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Glutaraldehyd trong 10 phút đã đủ để tiêu độc nhưng để giết chết bào tử cần tới 12 giờ.

Các khí diệt khuẩn

Có nhiều vật phẩm không chịu được nhiệt độ cao như các đĩa Petri bằng chất dẻo, các ống tiêm nhựa, các bộ phận của máy tim-phổi nhân tạo, các ống dẫn, ống nói… cần diệt khuẩn bằng khío ethylene oxide (EtO). EtO có thể kết hợp với protein, có thể làm chết cả vi sinh vật lẫn bào tử. EtO nhanh chóng xuyên qua được các bao bì bằng chất dẻo nên là một loại chất tiêu độc đặc biệt hiệu quả.

Tiêu độc bằng EtO rất giống với tiêu độc trong nồi cao áp. Cần khống chế nồng độc EtO, nhiệt độ và độ ẩm. Với EtO thuần khiết thường dùng nồng độ 10-20% phối hợp với CO₂ hay dichlorodifluorromethane. Với các vật dụng sạch cần xử lý ở 38°C trong 5-8 giờ, nếu ở 54°C cần xử lý trong 3-4 giờ. Nồng độ EtO là là 700mg/lít.Vì EtO có độc tính lớn cho nên sau khi tiêu độc cần thổi khí mạnh để loại trừ hết EtO đi.

Betapropiolactone (BPL) cũng là loại khí dùng để tiêu độc. Trong trạng thái lỏng BBL dùng để tiêu độc văcxin và huyết thanh. BBL sẽ bị phá hủy thàn dạng vô hoạt tính sau vài giờ chứ không khó loại trừ như EtO. Năng lực diệt khuẩn tuy cao hơn EtO nhưng khả năng xuyên thấu qua vật liệu lại kém hơn so với EtO. Hơn nữa chất này có thể gây ung thư cho nên không được ứng dụng rộng rãi như EtO.

Gần đây hydrogen peroxide dạng bay hơi cũng được dùng để tiêu độc các phòng thao tác an toàn sinh học