Bộ xét nghiệm phát hiện YHV1 và GAV gây bệnh đầu vàng trên tôm

> Bộ xét nghiệm phát hiện YHV1 và GAV gây bệnh đầu vàng trên tôm

Bộ xét nghiệm phát hiện YHV1 và GAV gây bệnh đầu vàng trên tôm

NKYHV1/GAV RT multiplex PCR kit- Bộ xét nghiệm phát hiện virus gây bệnh đầu vàng trên tôm 

Model: NKYHV1/GAV RT multiplex PCR

Giá: liên hệ 

NKYHV1/GAV RT multiplex PCR kit được sử dụng để phát hiện và phân biệt mẫu tôm lành hay tôm bệnh nhiễm virus YHV1 hay GAV (gây nên bệnh đầu vàng trên tôm). Kết quả này sẽ giúp các trại tôm giống hay các nhà nuôi tôm có biện pháp xử lý phù hợp. Bộ thử nghiệm còn có thể được sử dụng tại các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm sản phẩm thủy hải sản để phát hiện các sản phẩm mang mầm bệnh.

Chia sẻ

Share

NKYHV1/GAV RT multiplex PCR kit- Bộ xét nghiệm phát hiện YHV1/GAV gây bệnh đầu vàng trên tôm 

Model: NKYHV1/GAV RT multiplex PCR

Giá: liên hệ 

Phạm vi áp dụng

Được sử dụng để phát hiện và phân biệt mẫu tôm lành hay tôm bệnh nhiễm YHV1 hay GAV. Kết quả này sẽ giúp các trại tôm giống hay các nhà nuôi tôm có biện pháp xử lý phù hợp. Bộ thử nghiệm còn có thể được sử dụng tại các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm sản phẩm thủy hải sản để phát hiện các sản phẩm mang mầm bệnh.

Bệnh đầu vàng trên tôm thẻ chân trắng

Nguyên tắc hoạt động của bộ thử nghiệm

Bộ thử nghiệm được thiết kế theo qui trình của OIE 2009. Nguyên tắc của bộ thuốc thử là tách chiết RNA toàn phần từ các mẫu thử rồi phiên mã ngược các RNA thành cDNA bằng mồi ngẫu nhiên. Sau đó cho cDNA vào PCR mix có các mồi GY2, Y3 và G6 khuếch đại các trình tự đặc hiệu YHV1 (277bps) và GAV (406bps), nhờ vậy mà có thể phân biệt mẫu không nhiễm (không có sản phẩm khuếch đại), nhiễm YHV1 (có sản phẩm 277bps), hay nhiễm GAV (có sản phẩm 406bps). Ngoài ra, để kiểm soát khả năng tách chiết cũng như nguy cơ ức chế, trong PCR mix còn có mồi đặc hiệu cho gene giữ nhà của giáp xác 10 chân cho sản phẩm PCR là 90bps bắt buộc phải hiện diện trong các mẫu thử cho kết quả âm tính thật sự.

Năm ưu điểm của phương pháp này là: (1) Được cung cấp kèm với bộ tách chiết RNA và bộ tổng hợp cDNA rất hiệu quả và dễ dàng sử dụng. (2) Được cung cấp kèm với các PCR mix được chế tạo từ các hóa chất có chất lượng nhất và các primers theo qui trình của OIE 2009 cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất; (3) Được cung cấp kèm với hệ thống khuếch đại gene giữ nhà nhờ vậy giúp người sử dụng kiểm soát độ nhạy trong quá trình xét nghiệm PCR cũng như kiểm soát ức chế; (4) Được cung cấp kèm chứng [+] là plasmid đã chèn trình tự đặc hiệu cho GAV và plasmid này đã được pha ở một nồng độ vừa phải đủ để kiểm soát độ nhạy các PCR mix và cho các vạch khuếch đại đúng kích thước trình tự đích để giúp người sử dụng dễ đọc kết quả trên gel điện di; (5) Sử dụng men hotstart taq polymerase nên tránh được khuếch đại không đặc hiệu, đồng thời trong PCR mix có UNG và dUTP nên có khả năng loại trừ được ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại.

Tên bộ thử nghiệm và thành phần

Tên bộ thử nghiệm: NKYHV1/GAV RT multiplex PCR kit

Thành phần:  Cung cấp tất cả các thành phần đủ để làm xét nghiệm  trên 50 mẫu thử bao gồm các chứng và mẫu

LOD của bộ thử nghiệm:   80 copies virus/ml dịch nghiền mẫu trước khi tách chiết RNA

 

Thành phần thuốc thử

 

Nôi dung thuốc thử

 

Số lượng

Dành cho khuếch đại nucleic acid
NKcDNA synthesis kit Trọn bộ Bộ x 1
NKYHV1/GAV multiplex PCR mix Mồi đặc hiệu riêng cho GAV và cho YHV1, Mồi đặc hiệu cho gene của giáp xác, MgCl2, Tris HCl, KCl, taq polymerase, dNTP, UNG, dUTP 18ml x 72
Dành cho chứng và chuẩn
NKYHV1/GAVDNA chứng [+] Plasmid chèn DNA mục tiêu của PCR 300ml x 2
Chứng [-] TE1X 100ml x 1
Dành cho tách chiết nucleic acid từ bệnh phẩm
NKRNAPREP Trọn bộ Bộ x 1
Dành cho đọc kết quả phát hiện sản phẩm khuếch đại
NKAGE Trọn bộ thuốc thử điện di Bộ x 1

Kiểm tra chất lượng

Theo hệ thống quản lý chất lượng GMP/GLP/ISO, mỗi lot của thành phần bộ thử nghiệm là đã được kiểm tra chất lượng bởi một đơn vị kiểm tra chất lượng độc lập, theo qui trình kiểm tra chất lượng chuyên biệt và các thuốc thử chuyên biệt cho kiểm tra chất lượng. Giấy kết quả kiểm tra chất lượng luôn được kèm theo bộ thử nghiệm với đầy đủ các chi tiết về lot sản xuất cùng với qui trình và kết quả kiểm tra chất lượng, ngày thực hiện kiểm tra chất lượng và nhân viên thực hiện kiểm tra chất lượng. Ứng với mỗi lot thuốc thử, sẽ có một số mẫu được công ty lưu tại theo đúng yêu cầu bảo quản. Khách hàng nên lưu lại giấy kiểm tra chất lượng của lot thuốc thử đang sử dụng để bất cứ khi nào có sự than phiền của khách hàng về chất lượng thì bộ phận kiểm tra chất lượng sẽ lấy ra để thực hiện kiểm tra lại.

Các NKYHV1DNA chứng [+] và bộ thuốc thử NKRNAPREP phải được giữ ở nhiệt độ 2-8oC để đảm bảo không bị mất độ nhạy cho đến ngày hết hạn sử dụng.

Các NKYHV1/GAV multiplex PCR mix, bộ thuốc thử NKcDNA synthesis, và chứng [-] phải được giữ ở -18oC hay thấp hơn (nhưng không nên dưới -25oC vì nhiệt độ thấp hơn sẽ làm hỏng enzyme taq-polymerase).

Trang bị cần thiết

Cần một phòng thí nghiệm PCR có cách tổ chức theo đúng đòi hỏi của một phòng thí nghiệm chẩn đoán*, trang bị các thiết bị và dụng cụ sau đây: (1) Lab hood, có thể là loại khí tĩnh hay là một hood an toàn sinh học cấp 2 có đèn UV để khử nhiễm và đèn huỳnh quang để làm việc; (2) Máy ly tâm lắng có rotor cho thanh 8 tube PCR 0.2ml; (3) Máy ly tâm 13,000rpm có rotor cho 12 hay 24 tube 1.5-2ml; (4) Máy ủ nhiệt khô có thể điều chỉnh nhiệt độ 40oC đến 100oC được đặt trong lab hood dành để làm mẫu thử; (5) Máy lắc rung (Vortex); (6) Máy bơm chân không; (7) Micropipette 2-50µl; (8) Micropipette 20-200µl; (9) Micropipette 100-1000µl; (10) Các lọ chuyên dùng để bỏ các vật liệu hay thuốc thử đã dùng xong; (11) Máy PCR: Tốt nhất là máy có nguồn gốc Âu Mỹ như Eppendor, Techne, Biorad, ABI…..

*Phòng thí nghiệm có thể tổ chức thành 2 phòng hay 2 khu vực làm việc: (1) Khu vực không nhiễm, trang bị các thiết bị thuộc các mục 1, 2, 3, 5, 8, 10, và (2) khu vực làm mẫu thử trang bị các thiết bị 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Ngoài ra, phòng thí nghiệm phải trang bị tối thiểu một tủ đông đạt được nhiệt độ -18oC hay thấp hơn, và một tủ lạnh có ngăn đá riêng biệt. Các tủ lạnh và tủ đông này được dùng để chứa các thuốc thử theo đúng nhiệt độ bảo quản và các mẫu thử trong thời gian chờ làm xét nghiệm.

Phương pháp

Mẫu thử

Tôm sú trưởng thành, tôm bố mẹ, hay tôm post. Cũng có thể khảo sát cặn trong hồ nuôi hay nước nuôi tôm.

Phương pháp

1. Chuẩn bị mẫu thử

Tùy từng lọai mẫu thử mà có phương pháp chuẩn bị thích hợp.

  • Đối với mẫu tôm post, tôm giống: lấy mẫu nguyên 50-70 con còn sống (là tốt nhất) hoặc cố định trong cồn 950.
  • Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10-15 con (tổng lượng mẫu không qúa 1 gram). Lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 950.
  • Tôm bố mẹ: lấy mẫu mắt, chân bò, hoặc chân bơi hoặc một phần mang. Lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 950.
  • Mẫu giáp xác hoang dã: lấy một phần mang các loại động vật này (tổng lượng mẫu không qúa 1 gram). Lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 950.
  • Mẫu môi trường: lấy 4-5ml mẫu nước và phân trong bể hay ao nuôi, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10-15 phút. Loại bỏ dịch nổi, dồn cặn vào một ống nghiệm sạch. Lặp lại ly tâm một lần nữa, bệnh phẩm là phần cặn sau ly tâm.

2. Tách chiết RNA các mẫu thử

Tiến hành tách chiết RNA các mẫu thử với kit NKRNAPREP của Nam Khoa. Qui trình tách chiết theo đúng hướng dẫn đính kèm bộ kit (xem phụ lục). Cũng có thể sử dụng các kit tách chiết RNA khác nhưng phải thử trước với mẫu thử [+] (đặt nhà sản xuất cung cấp “mẫu [+] YHV1/GAV”) để xem hiệu quả tách chiết có tốt không rồi hãy sử dụng.

3. Tổng hợp cDNA

Sử dụng NKcDNAsynthesis kit để thực hiện phản ứng RT với mồi ngẫu nhiên phiên mã ngược RNA trong các dịch tách chiết RNA ở trên thành cDNA theo hướng dẫn của bộ kit (xem phụ lục).

4. Chạy PCR để khuếch đại các đoạn DNA đặc hiệu GAV và YHV1

Đối với mỗi mẫu cDNA từ các mẫu thử: Ứng với mỗi mẫu cDNA, lấy 2ml cho vào một tube PCR chứa 18ml NKYHV1/GAV multiplex PCR mix

Đối với chứng [+]: Ứng với mỗi lần thực hiện thử nghiệm, phải cho 2ml NKYHV1/GAVDNA chứng [+] vào một tube PCR chứa 18ml NKYHV1/GAV multiplex PCR mix để kiểm tra độ nhạy của PCR mix và có được sản phẩm PCR [+] làm chứng nhằm so sánh với các mẫu thử khi điện di phân tích kết quả.

Đối với chứng [-]: Ứng với mỗi lần thực hiện thử nghiệm, phải cho 2ml chứng [-] vào một tube PCR chứa 18ml NKYHV1/GAV multiplex PCR mix để để chứng minh thao tác thí nghiệm không bị ngoại nhiễm.

Cho tất cả vào buồng ủ máy PCR, chạy PCR vòng ngoài theo chương trình luân nhiệt như sau: 1 chu kỳ 40oC/10 phút để loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại, kế đó 1 chu kỳ 95oC/15’ để kích hoạt hotstart taq polymerase; tiếp theo là 5 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước nhiệt độ: 94oC/30’’, 66oC/30’’,  72oC/45’’, và cuối cùng 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước nhiệt độ: 94oC/30’’, 57oC/30’’,  72oC/45’’ và cuối cùng là 1 chu kỳ 72oC trong 5 phút.

5. Đọc và phân tích kết quả bằng điện di phát hiện sản phẩm khuếch đại trên gel điện di

Chuẩn bị gel agarose 2% pha trong TBE 0.5X bằng bộ NKAGE theo đúng qui trình được hướng dẫn (xem phụ lục). Cho 2ml đệm tải (NKLoading buffer) và 3ml sản phẩm PCR, dùng micropipette trộn đều sau đó cho hỗn hợp này vào giếng theo thứ tự, chừa 1 giếng để cho 15µl thang DNA. Chạy điện di với điện thế ổn định là 100 hay 125 volts với thời gian khoảng 30 phút hay cho đến khi vạch màu xanh chạy về cực [+] cách xa khởi điểm khoảng 4cm. Đọc kết quả trên hộp đèn UV 312nm.

Chụp hình gel điện di rồi phân tích kết quả như sau:

(1) Thang DNA phải tách rời với đủ 10 band rõ nét để chứng tỏ gel diện di và kỹ thuật điện di đạt yêu cầu về chất lượng.

(2) Giếng C [-] phải không có hiện diện vạch khuếch đại đặc hiệu 406 và/hay 277 bps để chứng minh không có ngoại nhiễm trong quá trình cho mẫu vào các PCR mix.

(3) Giếng C [+] phải có vạch khuếch đại 277bps và 406bps để chứng minh PCR mix đạt độ nhạy.

(4) Giếng PCR của mẫu nếu có vạch 277bps thì kết luận mẫu nhiễm YHV1; nếu có vạch 406bps thì kết luận mẫu nhiễm GAV; nếu có cả hai vạch 277bps và 406bps thì kết luận mẫu nhiễm YHV1 và GAV.

(5) Nếu không có vạch khuếch đại 277bps và 406bps thì kết luậnmẫu âm nghiệm với điều kiện phải có vạch khuếch đại 90bps, còn nếu không có vạch 90bps thì phải kết luận mẫu bị ức chế, phải lấy lại mẫu hay là phải làm lại mẫu.

Bảng dưới đây hướng dẫn cách đọc kết quả trên gel điện di.

Bảng 1: Tóm tắt cách đọc và biện luận kết quả trên gel điện di

Các vạch khuếch đại Kết luận
Vạch 90bps Vạch 277bps Vạch 406bps
Thang DNA Rõ nét và tách rời đủ 10 vạch Điện di đạt chất lượng
Không rõ nét, không tách rời đủ 10 vạch Điện di Ø đạt chất lượng
Chứng [+] [-] [+] [+] PCR mix đạt độ nhạy
[-] [-] [-] PCR mix Ø đạt độ nhạy
Chứng [-] [-] [-] [-] Không ngoại nhiễm
[+] hay [-] [-] [+] Có ngoại nhiễm
Mẫu thử [+] [-] [-] Mẫu âm nghiệm
[-] [-] [-] Mẫu bị ức chế
[+ hay -] [+] [-] Mẫu nhiễm YHV1
[+ hay -] [-] [+] Mẫu nhiễm GAV
[+ hay -] [+] [+] Mẫu nhiễm YHV1 và GAV

Lưu ý về an toàn

Bộ thuốc thử NKRNAPREP chứa hóa chất chaotropic và phenol trong thuốc thử R1. Đây là các chất có thể gây bỏng da hay niêm mạc. Do vậy nếu người sử dụng bị tai nạn vấy nhiễm R1 lên da hay mắt thì phải lập tức rửa ngay dưới vòi nước và sau đó phải đi bác sĩ để xin được khám để có tham vấn hay điều trị thích hợp. Ngoài ra, thuốc thử R2 là chloroform có thể gây cháy, do vậy không được thao tác gần lửa. Vì mẫu thử là dịch sinh học mẫu thử thuỷ sản, khi thao tác với các mẫu thử, tránh vấy nhiễm mẫu thử ra môi trường. Do vậy phải thao tác tuân thủ kỹ thuật vô trùng và phải thao tác trong tủ thao tác an toàn sinh học lớp II. Các vật liệu hay thuốc thử đã dùng xong phải được chứa trong các lọ chuyên biệt để được xử lý theo qui trình xử lý chất thải có nguy cơ độc hại và nguy cơ lây nhiễm.

Bộ xét nghiệm phát hiện YHV1 và GAV gây bệnh đầu vàng trên tôm được cung cấp bởi

CÔNG TY CỔ PHẦN ĐẦU TƯ THƯƠNG MẠI DỊCH VỤ TIN CẬY

Địa chỉ: Số 4, Đường số 3, Khu Đô Thị Vạn Phúc, Quốc lộ 13, P. Hiệp Bình Phước, Q.Thủ Đức, Tp.HCM

Điện thoại: (028) 2253 3535  –  Mobile: 0903 908 671    –    Fax: (028) 2253 3377 

Email: kinhdoanh@tincay.com; tincaygroup@gmail.com; tincay@tincay.com

Đánh giá

Chưa có đánh giá nào.

Be the first to review “Bộ xét nghiệm phát hiện YHV1 và GAV gây bệnh đầu vàng trên tôm”

Danh mục sản phẩm